1.樣品前處理與提取
液態樣品(如巴氏殺菌乳、含乳飲料):稱取5g樣品,加入磷酸鹽緩沖液Ⅱ(pH7.5±0.2),渦旋混勻后定容至25mL,低溫離心(10000r/min,15min)取中間層澄清液,重復離心2次以提高純度。
固態樣品(如乳粉、嬰幼兒配方食品):稱取1g樣品,用溫熱(≤50℃)磷酸鹽緩沖液Ⅱ溶解并定容至50mL,離心后取30mL上清液,通過肝素親和柱固相萃取凈化,洗脫液定容至5mL供檢測。
2.檢測方法選擇與操作
免疫學方法:
ELISA雙抗體夾心法:包被特異性抗乳鐵蛋白抗體,加入樣品孵育后,用酶標二抗檢測,通過吸光度值定量(檢測限達3ng/mL),適用于高通量快速篩查。
免疫擴散法:在瓊脂凝膠中形成抗原-抗體沉淀環,直徑與乳鐵蛋白濃度成正比,用于定性或半定量分析。
色譜法:
高效液相色譜(HPLC):采用C4反相色譜柱,流動相為0.1%乙腈梯度洗脫,紫外檢測器280nm波長檢測,通過外標法定量,線性相關系數≥0.999,適用于高純度樣品。
超高效液相色譜-質譜聯用(UHPLC-MS/MS):結合特征肽段質譜圖匹配,實現高靈敏度定性定量,可區分牛乳鐵蛋白與人乳鐵蛋白,適用于復雜基質樣品。
3.質量控制與驗證
方法驗證:通過線性范圍、重復性(RSD≤5%)、回收率(80%-120%)及檢出限驗證,確保方法符合國家標準(如NY/T4439-2023)及國際標準(如ISO22071)。
質量控制:每批樣品需包含陰性對照(無乳鐵蛋白樣品)和陽性對照(標準品),并定期進行儀器校準(如紫外檢測器波長準確性、色譜柱柱效測試)。
數據記錄與追溯:采用電子記錄系統(符合21CFRPart11)保存原始數據,確保檢測過程可追溯,結果報告包含檢測方法、判定標準及結論。
4.活性維護與特殊處理
溫度控制:全程在4℃以下操作,避免乳鐵蛋白變性失活;洗脫液保存于-20℃以下,防止降解。
雜質去除:通過肝素親和柱選擇性吸附乳鐵蛋白,去除酪蛋白、乳白蛋白等干擾成分,確保檢測特異性。
活性驗證:對提取的乳鐵蛋白進行功能驗證(如鐵結合能力、抗菌活性),確保檢測結果反映其生物活性。
技術亮點總結
高靈敏度與特異性:結合免疫學與色譜-質譜技術,實現低至ng/mL級的定量檢測,特異性抗體的使用避免交叉反應。
全流程標準化:從樣品采集到結果報告,嚴格遵循國家標準及國際規范,確保結果可比性與可靠性。
活性維護技術:通過低溫操作、特異性凈化及活性驗證,確保檢測結果反映乳鐵蛋白的生物功能,適用于科研、臨床及工業應用。
